分段扩增法克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA并鉴定其序列
【作者】
董晓
[1] ;
柯尊平
[2] ;
王俊峰
[1] ;
周明
[1] ;
李军
[1] ;
许海军
[1] ;
谭利
[1] ;
党书毅
[1]
【关键词】
脂氧合酶
DNA
互补
RNA
【摘要】
目的5-脂肪氧合酶(5-LO)是炎性介质白三烯合成过程中的限速酶,本研究克隆大鼠5LO cDNA编码区,旨在为利用大鼠5-L0分析白三烯在血管壁炎症中的作用做准备。方法从SD大鼠胚肝中提取mRNA并逆转录成cDNA,找出5-LOcDNA中独特的内切酶位点,再设计2对引物,扩出都含此酶切位点的5-LOcDNA片段。用高保真酶分段扩增出2个5-LOcDNA片段,再正确拼接,克隆成功后酶切鉴定并测序。将获取的cDNA序列与NCBI和Ensembl数据库比较序列的差异。结果用Oligo(dT)和随机引物从SD大鼠胚肝总111RNA中逆转录cDNA。以5-LOcDNA独特的PmlI内切酶位点为分界点,扩增出5’端1339bp和3’端790bp的5-LOcDNA片段,将2个片段正确地拼接在pBluescript1ISK(+)中。经EcoRI和XhoI酶切和测序显示,重组质粒中包含有5-LOcDNA编码区全长2025bp,它与Ensembl数据库中的序列完全一致,但与NCBI数据库中的序列有较大的差异。结论用分段扩增法从SD大鼠胚肝中成功克隆出全长5-LOcDNA编码区,并证实了其序列的正确性。
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